Edición genética del gen EWSR1::FLI1 bloquea la proliferación celular en el sarcoma de Ewing

El sarcoma de Ewing es un tumor maligno que afecta principalmente a niños y adultos jóvenes, con una alta dependencia del oncoproteína de fusión EWSR1::FLI1, resultado de una translocación cromosómica característica de la enfermedad. Aunque los tratamientos actuales combinan quimioterapia, radioterapia y cirugía, los pacientes con enfermedad metastásica o refractaria enfrentan un pronóstico desalentador. En este contexto, la inactivación selectiva del EWSR1::FLI1 representa una estrategia terapéutica prometedora.

El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la edición génica mediante CRISPR/Cas9 dirigido por el promotor GGAA, que permite la expresión específica de Cas9 en células con EWSR1::FLI1, minimizando efectos fuera de objetivo en células normales.

¿Qué se utilizó?

El estudio empleó un enfoque experimental basado en líneas celulares, clonación genética, ensayos de reporter luciferasa, análisis de edición génica y modelos in vivo. A continuación, se describen las técnicas clave utilizadas:

Datos a tener en cuenta 👀

• Se emplearon diferentes líneas celulares para evaluar la expresión y actividad de Cas9:

• El promotor GGAA, responsable de dirigir la expresión específica de Cas9 en células con EWSR1::FLI1, se clonó a partir del gen NR0B1 en un vector reportero de luciferasa.

• Para confirmar la especificidad del promotor GGAA, se realizaron ensayos de luciferasa en células transfectadas con EWSR1::FLI1 o su versión nativa FLI1, demostrando que la activación solo ocurre en células con EWSR1::FLI1.

• Se establecieron líneas celulares con Cas9 regulado por el promotor GGAA para evaluar su capacidad de inactivar EWSR1::FLI1 y afectar la proliferación celular.

• Se diseñaron ARN guía (gRNA) dirigidos a los exones 2 y 9 de FLI1, con la finalidad de interrumpir la función de la oncoproteína.

• Se utilizó el ensayo de resazurina para evaluar el impacto de la edición génica en la proliferación de células de sarcoma de Ewing.

• Se administraron vectores adenovirales con Cas9 en ratones con tumores de sarcoma de Ewing, evaluando la expresión de luciferasa y la progresión tumoral.

  
  

¿Qué encontraron?

Los hallazgos clave del estudio demostraron que la inactivación de EWSR1::FLI1 mediante CRISPR/Cas9 inducida por GGAAprom es altamente específica y reduce la proliferación celular en modelos in vitro e in vivo.

El ensayo de luciferasa demostró que el promotor GGAA solo se activa en células de sarcoma de Ewing, sin actividad en otras líneas celulares como HT1080 (fibrosarcoma) o Saos-2 (osteosarcoma).

En modelos murinos, la administración de adenovirus con Cas9 bajo GGAAprom redujo el crecimiento tumoral de manera dependiente de la dosis.

La inmunohistoquímica con Ki67 confirmó la reducción de células proliferativas en los tumores tratados con Cas9 bajo GGAAprom.

El estudio demuestra que la inactivación del EWSR1::FLI1 mediante CRISPR/Cas9, dirigido por el promotor GGAA, es una estrategia prometedora para el tratamiento del sarcoma de Ewing. La alta especificidad de esta terapia minimiza efectos fuera de objetivo y ofrece una nueva vía para el desarrollo de terapias génicas dirigidas. Se requieren estudios adicionales para optimizar la administración y evaluar su eficacia en modelos preclínicos avanzados.